Holländska forskare kombinerar CRISPR och bioluminescens i ett experimentellt test förinfektionssjukdomar

Ett nyutvecklat nattligt protein skulle kunna påskynda och förenkla diagnosen av virussjukdomar, enligt forskare i Nederländerna.
Deras studie, publicerad i onsdags i ACS Publications, beskriver en känslig, enstegsmetod för att snabbt analysera virala nukleinsyror och deras utseende med hjälp av lysande ljusblå eller gröna proteiner.
Identifieringen av patogener genom att detektera deras nukleinsyrafingeravtryck är en nyckelstrategi inom klinisk diagnostik, biomedicinsk forskning och övervakning av livsmedels- och miljösäkerhet.De allmänt använda kvantitativa polymeraskedjereaktionstesterna (PCR) är mycket känsliga, men kräver sofistikerad provberedning eller tolkning av resultat, vilket gör dem opraktiska för vissa vårdmiljöer eller resursbegränsade miljöer.
Denna grupp från Nederländerna är resultatet av ett samarbete mellan forskare från universitet och sjukhus för att utveckla en snabb, portabel och lättanvänd metod för diagnostik av nukleinsyra som kan användas i en mängd olika miljöer.
De inspirerades av eldflugeblixtar, eldflugeljus och små stjärnor av vattenlevande växtplankton, alla drivna av ett fenomen som kallas bioluminescens.Denna glöd-i-mörker-effekt orsakas av en kemisk reaktion som involverar luciferasproteinet.Forskarna inkorporerade luciferasproteiner i sensorer som avger ljus för att underlätta observation när de hittar ett mål.Även om detta gör dessa sensorer idealiska för punkt-of-care-detektion, saknar de för närvarande den höga känslighet som behövs för kliniska diagnostiska tester.Även om CRISPR-genredigeringsmetoden kan tillhandahålla denna förmåga, kräver den många steg och ytterligare specialiserad utrustning för att upptäcka den svaga signalen som kan finnas i komplexa, brusiga prover.
Forskare har hittat ett sätt att kombinera ett CRISPR-relaterat protein med en självlysande signal som kan detekteras med en enkel digitalkamera.För att säkerställa att det fanns tillräckligt med RNA- eller DNA-prov för analys utförde forskarna rekombinaspolymerasamplifiering (RPA), en enkel teknik som arbetar vid en konstant temperatur på cirka 100 °F.De utvecklade en ny plattform som heter Luminescent Nucleic Acid Sensor (LUNAS), där de två CRISPR/Cas9-proteinerna är specifika för olika sammanhängande delar av det virala genomet, var och en med ett unikt luciferasfragment fäst till dem ovan.
När det specifika virala genomet som utredarna undersöker är närvarande binder två CRISPR/Cas9-proteiner till målnukleinsyrasekvensen;de blir nära varandra, vilket gör att intakt luciferasprotein kan bildas och avge blått ljus i närvaro av ett kemiskt substrat..För att ta hänsyn till substratet som förbrukades i denna process använde forskarna en kontrollreaktion som avgav grönt ljus.Ett rör som ändrar färg från grönt till blått indikerar ett positivt resultat.
Forskarna testade sin plattform genom att utveckla RPA-LUNAS-analysen, som detekterarSARS-CoV-2 RNAutan tråkig RNA-isolering och visade sin diagnostiska prestanda på nasofaryngeala pinnprover frånCOVID 19patienter.RPA-LUNAS upptäckte framgångsrikt SARS-CoV-2 inom 20 minuter i prover med en RNA-viral belastning så låg som 200 kopior/μL.
Forskarna tror att deras analys enkelt och effektivt kan upptäcka många andra virus."RPA-LUNAS är attraktivt för testning av infektionssjukdomar på vårdplatsen", skrev de.